Einzelmolekül-Fluoreszenz

Einzelmolekül-Fluoreszenzexperimente

Zusammenfassung

In diesem Experiment werden Sie sich genauer mit dem Förster-Resonanzenergietransfer (FRET), zwischen einem Donor- und einem Akzeptor-Fluorophor an einzelnen Molekülen, beschäftigen. Ziel des Experimentes ist der Beweis des Prinzips, indem FRET zwischen Fluorophoren gemessen wird. Die Fluorophore sind hierbei an doppelsträngiger DNA befestigt (siehe Schema) und auf einem Deckglas immobilisiert. Mit Hilfe der durchgeführten Messung werden Sie dann die FRET-Effizienz aus den gemessenen Daten berechnen und anschließend mit der Förster-Gleichung den tatsächlichen Abstand zwischen den beiden, an DNA-Moleküle gebundenen, Fluorophoren bestimmen.

Das Experiment beinhaltet:

Vorbereitung des Probenhalters und Immobilisierung der DNA-Moleküle auf der Oberfläche
Anregung der Donormoleküle mit einem 532 nm Laser (in den Abbildungen dargestellt)
Erfassung der Fluoreszenzemission von Donor- und Akzeptor-Fluorophoren mit einem High-End-Wasserobjektiv
Aufzeichnung der Intensitätsdaten mit einer fortschrittlichen EMCCD-Kamera (in den Abbildungen dargestellt)
Extrahieren der FRET-Effizienz für einzelne Moleküle aus der Messung
Analysieren der resultierenden Spuren, um das endgültige FRET-Effizienzhistogramm zu erhalten
Umwandeln des FRET-Effizienzhistogramms in ein Abstandshistogramm, das die Trennung zwischen den Donor- und Akzeptor-Fluorophoren darstellt

Der Betreuer hilft Ihnen bei der Vorbereitung der Probenkammer, zeigt Ihnen, wie Sie die Oberfläche passivieren und die DNA-Moleküle immobilisieren. Nachdem die an der Oberfläche angebrachten Moleküle, mit dem Mikroskop, fokussiert wurden, nehmen Sie Videos aus mehreren Regionen der Probenhalter auf, um eine angemessene Menge an Statistiken zu sammeln. Danach analysieren Sie die resultierenden Intensitätsspuren, um die Detektionkorrekturfaktoren zu bestimmen und dadurch das endgültige FRET-Effizienzhistogramm zu berechnen.

Kontakt: Pooyeh Asadi, E-Mail: poaspc@cup.uni-muenchen.de